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Desde su primera comunicación en el año 1973, un gran núme-
ro de estudios han considerado la posible etiología de MD sin
poder esclarecer las causas subyacentes de esta enfermedad.
Investigaciones recientes han identificado como causa proba-
ble una mutación del gen SOD1 que codifica la Superóxido
Dismutasa 1 (SOD1), lo que implica también que la MD es un
potencial ortólogo de la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) del
ser humano (Awano et al. 2009).
Por muchos años se pensó que MD era una enfermedad que
involucraba en forma primaria solamente los tractos ascenden-
tes y descendentes de la médula espinal. En concordancia con
este concepto, en el inicio del cuadro clínico los resultados
del examen neurológico son consistentes con enfermedad de
motoneurona superior (MNS) (Averill, 1973; Griffiths y Duncan
1975; Braun y Vandevelde 1978). En esta etapa temprana, los
cambios patológicos son más evidentes en la médula de la re-
gión torácica, pero más tarde se extienden craneal y caudal-
mente y se hacen más severos a medida que la enfermedad
progresa (Matthews y de Lahunta 1985; Coates et al. 2007;
Awano et al. 2009; Kathmann et al. 2006). Más recientemente,
varias descripciones clínicas e histopatológicas indicaron que
MD se extiende más allá de la sustancia blanca medular, al me-
nos en los estadios avanzados, involucrando también a la mo-
toneurona inferior (MNI), al axón periférico y la miofibra (Awano
et al. 2009; Shelton et al. 2012; Morgan et al. 2013; Ogawa et
al. 2013). La distribución de las lesiones y la progresión clínica Universal Master MIx , DNTps, primers foward y reverse(IDT,
de la enfermedad son similares a los comunicados para ciertos
tipos de ELA, con un inicio caracterizado por signos de MNS
en los perros afectados, con progresión a signos de MNI que
se vuelven evidentes en estadios tardíos de la progresión de la
enfermedad.
Todos estos hallazgos confirman la similitud entre MD canina y
ELA de los humanos (Awano et al. 2009; Wininger et al. 2011).
El gen humano superóxido dismutasa (SOD1), localizado en
el brazo largo del cromosoma 21q22.11, codifica la enzima
antioxidante citosólica SOD1 (Green et al. 2002), proteína que
cataliza la dismutación de radicales superóxido a peróxido de
hidrógeno y oxígeno (Bannister et al. 1991; Stewart 2005). Las
mutaciones en el gen SOD1 han sido asociadas a ELA familiar,
contabilizando aproximadamente el 20% del total de los casos
de esta forma de ELA.
El gen canino SOD1, localizado en el cromosoma 31, compa-
rado con el gen y la proteína humanos, comparte una similitud
del 83% en relación a los nucleótidos, y del 79% en cuanto a
los aminoácidos (Green et al. 2002). Un estudio (Awano et al.
2009) ha establecido el punto de mutación en el exón 2 del gen
canino SOD1 (118G>A) en el 96% de los casos de MD exami-
nados, resultando en una sustitución del ácido glutámico a lisi-
na (E40K), convirtiendo a MD en un potencial ortólogo de ELA.
En ELA, la información sobre el estado genético ha permitido
la estratificación de los pacientes, lo que ha permitido mejorar
significativamente el diagnóstico y clarificar el pronóstico (An-
dersen et al. 1996; Andersen et al. 2003). En MD se ha dado
una situación similar a partir del descubrimiento de la mutación
SOD1. Este hecho significó una contribución clave en el con-
texto de la epidemiología genética en la población de perros
afectados por MD, y al mismo tiempo, permitió elaborar hipó-
tesis acerca de los potenciales mecanismos fisiopatológicos
subyacentes a esta enfermedad. Aunque la mutación no es
específica para MD, su identificación ha mejorado significativa-
mente el diagnóstico clínico, y ha sido utilizado como un mar-
cador genético para este trastorno (Awano et al. 2009; Wininger
et al. 2011).
En este trabajo, a partir de la información genética recopila-
da de estudios previos (Awano et al. 2009; Coates y Wininger,
2010) y de los hallazgos clínicos, hemos establecido un grupo
homogéneo de enfermos con un genotipo específico, desarro-
llando un protocolo particular adaptado a nuestras posibilida-
des y condiciones. Como una patente protege el uso de esta
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secuencia, se ha pedido autorización a sus propietarios para
desarrollar nuestro protocolo de genotipificación.
Materiales y Métodos
Muestras
Se recolectó sangre periférica con edta de 14 caninos los
cuales presentaban sospechas de padecer una enfermedad
neurológica progresiva, estos caninos fueron aportados por el
Doctor Fernando Pellegrino de su práctica privada, a su vez
se utilizó sangre con edta de 10 caninos controles los cuales
no presentaban ninguna signología neurológica, estos fueron
aportados por el Laboratorio Rapela.
Las edades de los caninos se encontraban entre 5 y 13 años,
las muestras fueron enviadas refrigeradas y almacenadas a 4
grados celsius.
Extracción de ADN
El ADN fue extraído siguiendo los pasos de extracción de ADN
Quick - gDNA Blood Miniprep de Zymo Reserch. Las muestras
de ADN obtenidas fueron corridas en gel de agarosa para ve-
rificar la presencia de material.
PCR real time
La reacción de PCRrt fue realizada con un volumen total de
25 ul los cuales consistian en la ADN polimerasa TAqMan
Integrated DNA Technology) , sondas (Molecular Probes® life
technologies) y las muestras de ADN.
El procesamiento fue realizado con el STEP ONE real-time pcr
system siguiendo los pasos aportados por el trabajo de la uni-
versidad di Torino. (Capucchio 2013)
Este estudio se desarrolló en base a una discriminación alélica
por qPCR (Reacción en cadena de Polimerasa) taqman MGB
en la mutación SOD1:c.118 G-A
Durante la amplificación las sondas fluorogenicas Taqman se
alinean específicamente a su secuencia complementaria entre
los primers fowards y revers, esta luego es degradada debido
la actividad exonucleasa 5´-3´ de la ADN polimerasa.
Una vez separada del quencher el colorante emite una fluores-
cencia que es medida por el real-time PCR system.
En este estudio las 2 sondas eran casi idénticas, solo diferian
en la secuencia en el extremo 5´, ademas el fluorocromo fue
distinto para cada sonda (fam y vic) con sus respectivas se-
cuencias marcadas.
La presencia simultánea de las 2 sondas permite la alineacion
de ambas, independientemente del alelo presente ya que esa
sola discordancia no perjudica la alineacion de las sondas al
ADN heterólogo.
Durante la extensión la actividad 5-3 exonucleasa de la ADN
polimerasas degrada la sonda idéntica al templado con la
consiguiente emisión de fluorescencia
Las sondas con el error es removida sin degradación y caren-
te de emisión fluorescencia.
El análisis post-PCR permite la visualización instantánea de
los resultados a través de la fracción específica, utilizando el
software SDS v1.2.10.
Todas las reacciones de PCRrt fueron realizadas en duplicado.
Todos las muestras a su vez fueron secuenciadas para su
confirmación utilizando ABI PRISM 310 genetic analizer.
Previamente se realizó la pcr para las muestras a secuenciar.
La reacción fue realizada en un volumen de 50 ul consisten-
tes en cada primer (IDT), DNA taq polimerasa (Invitrogen tm),
dNTPs y el molde de ADN.
El protocolo consistió en un paso inicial de activación a 95
grados por 15 minutos, seguido por 35 ciclos a 95 grados de
desnaturalización por 30 segundos, alineación a 60 grados
por 30 segundos y extensión a 72 grados por 30 segundos.
Una extensión final fue agregada a todas las reacciones.
Las amplificaciones fueron llevadas a cabo en el termocicla-
dor 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems)